Article
Mutation von GDF-5 steigert seine Fähigkeit zur ektopen Knochenbildung in einem β-TCP Scaffold
Search Medline for
Authors
Published: | October 15, 2009 |
---|
Outline
Text
Fragestellung: Für den Wachstumsfaktor GDF-5 werden schwächere osteoinduktive Effekte auf multipotente Vorläuferzellen berichtet als für andere Mitglieder der bone morphogenetic protein (BMP)-Familie wie z. B. BMP-2. Eine Ursache hierfür könnte die bevorzugte Bindung von GDF-5 an einen der beiden Typ I BMP-Rezeptoren (wesentlich stärkere Bindung an BMPR-Ib als an BMPR-Ia) darstellen, während bekannt ist, dass BMP-2 mit beiden Typ I Rezeptoren interagiert. Um diese Hypothese zu prüfen und die osteogene Potenz von GDF-5 zu erhöhen, war es Ziel dieser Studie, die Sequenz von GDF-5 im Bereich der Rezeptorbindungsstellen an die Verhältnisse in BMP-2 anzupassen und das mutierte GDF-5 auf seine osteogenen Eigenschaften in vitro sowie in einem Modell der ektopen Knochenbildung in vivo zu untersuchen.
Methodik: Durch ortsspezifische Mutagenese wurden mittels molekularbiologischer Methoden eine bzw. zwei Aminosäuren in GDF-5 ausgetauscht (jeweils Methionin zu Valin). Drei verschieden mutierte Proteine wurden in E. coli produziert und aufgereinigt. Ihre osteogene Potenz wurde dann mit der von BMP-2 verglichen. In vitro wurde die Alkalische Phosphatase-Aktivität (ALP) von MCHT1/26 und C2C12-Zellen nach Stimulation mit den Faktoren ermittelt. Für die in vivo Testung wurden β-TCP Träger mit 10 µg mutiertem GDF-5, Wildtyp GDF-5, BMP-2 oder Puffer allein gesättigt, getrocknet und subcutan in Mäuse transplantiert. Die Knochenbildung wurde nach 4 und 8 Wochen histologisch und durch µCT Analyse bestimmt.
Ergebnisse und Schlussfolgerungen: Durch zwei Mutationen im Bereich der Rezeptorbindungsstelle von GDF-5 erhöhte sich in vitro die ALP-Aktivität stimulierter C2C12-Zellen signifikant, die bevorzugt den BMPRIa Rezeptor tragen. In MCHT1/26-Zellen führten zwei Einzelmutationen zu deutlich erhöhten ALP-Werten und durch Kombination beider Mutationen im selben Molekül wurden additive Effekte auf die ALP erzielt. Daher wurde diese Doppelmutante mtGDF-5 weiter in vivo analysiert. Vier Wochen nach subcutaner Implantation hatten mtGDF-5 beladene β-TCP Träger histologisch und im µCT signifikant mehr neuen Knochen gebildet als Wildtyp GDF-5 und als BMP2 (p<0.003). Nach 8 Wochen blieb die Menge neugebildeten Knochens signifikant höher als die von Wildtyp GDF-5.
Durch Einführung von 2 Punktmutationen in GDF-5 konnte eine zusätzliche Bindung des Faktors an den BMPRIa Rezeptor vermittelt werden. Dies hatte eine höhere osteogene Potenz des mtGDF-5 zur Folge, die im Modell der ektopen Knochenbildung der von BMP-2 entsprach.