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Direkter rAAV-vermittelter Gentransfer von humanem FGF-2 und sox9 stimuliert Zellproliferation und Synthese von extrazellulärer Matrix in humanem normalen und arthrotischen Gelenkknorpel
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Published: | October 9, 2007 |
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Einleitung: Bei arthrotischen und traumatischen Knorpelschäden ist die Knorpelhomöostase pathologisch verändert. Fibroblastenwachstumsfaktor 2 (FGF-2) wirkt vorwiegend mitogen auf Chondrozyten, während der Transkriptionsfaktor Sox9 entscheidend für Knorpelbildung und Ausdifferenzierung der Chondrozyten ist. Wir testeten die Hypothese, daß ein direkter Gentransfer einer Kombination aus humanem FGF-2 und sox9 durch rekombinante adeno-assozierte virale Vektoren (rAAV) die Zellproliferation und die Synthese extrazellulärer Matrix in humanen normalen und arthrotischen Gelenkknorpelexplantaten moduliert.
Methode: Humane normale und arthrotische Gelenkknorpelexplantate wurden mit den neu klonierten Vektoren rAAV-hFGF-2 (humane FGF-2 cDNS) und rAAV-FLAG-hsox9 (FLAG-markierte humane sox9 cDNS) behandelt (je 20 ul) und 10 Tage kultiviert. Transgenexpression wurde durch Immunohistochemie und ELISA überprüft. Auswertungen erfolgten durch biochemische Bestimmung von DNS-Menge (Hoechst 33258), Proteoglykane (DMMB) und Typ-II-Kollagen (ELISA). Die statistische Auswertung erfolgte durch den t-Test und den Mann-Whitney Rank Sum Test.
Ergebnisse: Transgenexpression war in allen Knorpelschichten nachweisbar. FGF-2 war nur im mit rAAV-hFGF-2/rAAV-FLAG-hsox9 transduziertem Knorpel (26,5±4,9 pg/mg Trockengewicht; TG) nachzuweisen. Applikation von rAAV-hFGF-2 führte zu einer signifikanten Zunahme der Zelldichte (normaler Knorpel: 612±3 vs 294±2 und 295±2 Zellen/mm2; arthrotischer Knorpel: 646±3 vs 354±1 und 354±2 Zellen/mm2; P<0,001) und DNS-Menge (normaler Knorpel: 0,34±0,01 vs 0,25±0,02 und 0,25±0,02 ug/mg TG; arthrotischer Knorpel: 0,53±0,01 vs 0,33±0,02 und 0,33±0,01 ug/mg TG; P<0,001) im Vergleich zu rAAV-lacZ und rAAV-lacZ/rAAV-FLAG-hsox9. Applikation von rAAV-FLAG-hsox9 (rAAV-lacZ/rAAV-FLAG-hsox9 und rAAV-hFGF-2/rAAV-FLAG-hsox9) resultierte in einer signifikanten Zunahme des Proteoglykan-Gehalts (normaler Knorpel: 20,7±0,8 und 23,3±1,0 vs 13,5±1,0 ug/mg TG; arthrotischer Knorpel: 27,7±0,8 und 25,5±1,0 vs 16,8±0,8 ug/mg TG; P<0,001), der Typ-II-Kollagen-Immunfärbung (normaler Knorpel: 57,3±1,0% und 65,2±1,2% vs 10,5±1,0%; arthrotischer Knorpel: 62,0±1,4% und 72,2±1,2% vs 11,3±1,0%; jeweils P<0,001), und des Typ-II-Kollagen-Gehaltes (normaler Knorpel: 0,65±0,01 und 0,67±0,01 vs 0,24±0,02 ng/mg TG; arthrotischer Knorpel: 0,68±0,01 und 0,85±0,01 vs 0,43±0,01 ng/mg TG; P<0,001) im Gegensatz rAAV-lacZ behandelten Explantaten.
Schlussfolgerungen: Direkte, rAAV-vermittelte Überexpression einer Kombination von FGF-2 und sox9 stimuliert die Chondrozytenproliferation und die Synthese extrazellulärer Matrix sowohl in humanem normalen als auch arthrotischen Gelenkknorpel in situ. Diese Daten unterstützen das Konzept der kombinierten rAAV-Gentherapie zur Behandlung von arthrotischen und traumatischen Knorpelschäden.